Technologia Żywności :: Przegląd tematu

gostek · Wysłany: Czw 20:26, 17 Maj 2007 Temat postu:

Ma ktos cos wiecej na koło z Biotechnologi prosze o szybka odpowiedz

agatab40

Elektroforeza żelowa

W elektroforezie żelowej środowiskiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agaru, poliakrylamidów lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu centymetrów (rzadziej słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę roztworu analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu (studzienkę) zanurzonym w buforze pH. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe napięcie elektryczne rzędu 50- 2000 V. Ze względu na zróżnicowaną ruchliwość elektroforetyczną, różne cząsteczki w różnym stopniu oddalają się podczas analizy od miejsca naniesienia próby. Stopniowo ulegają więc rozdzieleniu.

Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.

DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.
Schemat postępowania jest następujący : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyciąga się. W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryzuje w świetle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.

Minimalna ilość DNA , którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.
Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.
Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.

1. Żele agarozowe.
Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).
Zaletą może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.

2. Żele akrylamidowe.

Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.

3. Żele denaturujące.

Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek , zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).

4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.

Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2.104 do 107 bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością a gdy zostaje wyłączone mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.
Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.
Istotne problemy przy izolacji to :

- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA
- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb
- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng
- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
Metody :

1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.

Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.

2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

3. Metoda "freeze-sqeeze".

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.